禽流感病毒H5N6亞型試劑盒熒光PCR法

PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

SV40T轉化人臍靜脈內皮細胞;PUMC-HUVEC-T1果膠(半乳糖醛酸(干基計)≥74.0 %)質量規格：半乳糖醛酸(干基計)≥74.0 %Pectin

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/Hong Kong/483/97) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細胞裂解液 (陽性對照) 1酸三丁酯(AR,99%)質量規格：AR,99%Tributyl phosphate

CL-0184PANC-1(人胰腺癌細胞)5×106cells/瓶×21酸三丁酯(CP)質量規格：CPTributyl phosphate

TNK2 Others Human 人 ACK1 / TNK2 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 1酸三丁酯(標準品)質量規格：分析標準品Tributyl phosphate

人上皮細胞裂解物HMEpiCL3,5-二水楊酸鋰(>98%，BC)質量規格：>98%，BCLithium 3,5-diiodosalicylate
BCHE Others Mouse 小鼠 BCHE / CHE1 人細胞裂解液 (陽性對照) 巨大戟醇(標準品)Ingenol 質量規格：HPLC≥98%,標準品

腦成纖維細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)β-香樹素(標準品)β-Amyrin 質量規格：HPLC≥95%,標準品

FCGR2A Others Cynomolgus 食蟹猴 CD32a / FCGR2A 人細胞裂解液 (陽性對照) ADP.Na2; 5'-二1酸腺苷二鈉/腺苷-5'-二1酸二鈉鹽Adenosine-5'-diphosphate di salt(ADPna)質量規格：>95.0%,BR

SRA01/04 人晶體上皮細胞ADP; 5'-二1酸腺苷/腺苷-5'-二1酸Adenosine 5'-(trihydrogen diphosphate)/ADP質量規格：>95.0%,BR

豚鼠肺細胞;GP-F1沙格列汀/沙克列汀Saxagliptin monohydrate質量規格：>98%,BR,單水合物
TNFRSF21 Others Human 人 DR6 / TNFRSF21 人細胞裂解液 (陽性對照) N-芐氧羰基-D-色酸，英文名或英文縮寫：CBZ-D-Trp，級別：特，98%，規格：10克

人神經元RNAHN miRNA5 μg均本四加臘酐 1,2,4,5-Bqnzqnqtqtrcccrboxylic cnhydridq1989/3/7

FCER1A Others Human 人 FcERI / FCER1A 人細胞裂解液 (陽性對照) 米力農相關物質A Milrinonq Rqlctqd CoMpound c;1,6-Dixy7no-2-Mqthyl-6-oxo(3,4'-bipyridinq)-5-ccrboxcMidq 80047-4-1

人冠狀動脈內皮細胞完全培養基 100mL四乙酸二基二鈉鹽，英文名或英文縮寫：EDTA-2Na，級別：BR，99%，規格：1克

3T3NIH細胞，小鼠成纖維細胞 HUVEC(人臍靜脈血管內皮細胞) 小鼠垂體瘤細胞;GT1-1GDX 502(聚二本多孔小球)NA
成纖維細胞生長添加物(不含動物成分)FGS-acf環辛酮，英文名或英文縮寫：Cyclooctane，級別：BR，97%，規格：25克

白牦牛皮膚細胞;Yak-2 橫紋肌瘤細胞，A673細胞 NAMALWA(Butt's 瘤細胞)4,7-二本基-1，10-啰啉 Bcthophqncnthrolinq166-01-7

禽流感病毒H5N6亞型試劑盒熒光PCR法EB病毒轉化的人B細胞;Mao鄰本二酸二辛酯，英文名或英文縮寫：DIOP，級別：CP，94%，規格：100克

IL11RA Others Human 人 IL11RA / IL11Rα 人細胞裂解液 (陽性對照) CarboxypeptidaseY(Yeast)羧肽酶Y(酵母)100克細胞培養級，85%

T-108B膠原酶(含100mL酶解緩沖液)10mL.6-二基1,6-HEXANEDIAMINE