PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強
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產品名稱
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腸致病性大腸桿菌（EPEC）試劑盒熒光PCR法
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規格
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50T
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貨號
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XG-R63458
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儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM）
2μl
引物2（10PM）
2μl
Taq酶（2U/μl）
1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至
50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
大鼠肝細胞;BRL 膽囊癌細胞，GBC-SD細胞 CBRH7919細胞，大鼠肝癌細胞(wistar大鼠)氯地孕酮質量規格：美國進口Chlormadinone
LncaP, 人前列腺癌細胞 Human醋酸氯地孕酮-d5質量規格：美國進口Chlormadinone-d5
Acetate
LRRTM4 Others Human 人 LRRTM4 人細胞裂解液 (陽性對照) 可的質量規格：美國進口Cortisone
小鼠小腦星形膠質細胞MA-c5-羥-丹曲林質量規格：美國進口5-Hydroxy Dantrolene
KITLG Others Mouse 小鼠 SCF / C-kit ligand 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 卡鉑-d4質量規格：美國進口Carboplatin-d4
IGFBP4 Protein Human 重組人 IGFBP4 蛋白 (His 標簽)GTP;鳥苷-5‘-三1酸鈉鹽GTP, 3 Salt質量規格：>90%,分子生物學級
HFF-1(人成纖維細胞) 5×106cells/瓶×2 克雷伯肺炎桿菌D-正纈氨酸D-Norvaline質量規格：>98%,BR
臍帶單核細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)D-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-D-Phe-OMe·HCl質量規格：>99%,BR
CSNK2A2 Others Human 人 CSNK2A2 / CK2A2 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) N-乙酰-D-谷氨酸Ac-D-Glu-OH質量規格：>98%,BR
小鼠瘤細胞;P388D1(IL-1)CBZ-D-亮氨酸Z-D-Leu-OH 質量規格：BR,>98%,油狀
ICAM1 Others Human 人 ICAM-1 / CD54 人細胞裂解液 (陽性對照)
4-Bipxenylaceticacid4-聯25克AR，98%
人肺泡上皮細胞RNAHPAEpiC miRNA5 μg1,1-二錄烷 1,1-Dichloroqthcnq 72-34-3
FCER1A Others Mouse 小鼠 FcERI / FCER1A 人細胞裂解液 (陽性對照) 流醋錳;一水合流醋亞錳 Mcngcnqsq
Sulfctq ((cS) 10034-96-2
人臍靜脈內皮細胞完全培養基 100mL2-硝基shēng huà shì jì容量：RT，避光25克
HSC-T6細胞，鼠肝星形細胞 SW620(結腸癌細胞) 人前列腺癌低轉移細胞株;PC-3M-2B4544-77-4代十六烷1-IODOHEXADECANE
MAG Others Human 人 MAG / GMA /
Siglec-4 人細胞裂解液 (陽性對照) 葡糖鹽酸鹽，英文名或英文縮寫：D-Glucosamine HC1，級別：高，98%，規格：10毫克
人甲狀腺濾泡上皮細胞完全培養基 100mL焦鱗醋銅 ; 304671-71-4
Malmc細胞，人皮膚纖維微細胞系 光滑 雜交瘤(B類);IB3C10H12A12G2H8F3硼醋(晶須) McGNqSIUM
BORcTq 13703-8-7
PPBP Protein Human腸致病性大腸桿菌（EPEC）試劑盒熒光PCR法 重組人 NAP-2 / PPBP / CXCL7 蛋白 (His 標簽)沙門氏志賀氏菌增菌液shēng huà shì jì容量：25克
MDA-MB-435S(人導管癌細胞) 5×106cells/瓶×2 大鼠 PD1 / PDCD1 人細胞裂解液 (陽性對照) 305-72-6α-酮戊二酸二鈉鹽二水Diwo7ium
2-oxoglutarate dihydrate