腸出血性大腸桿菌（EHEC）試劑盒熒光PCR法

產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
成纖維細胞培養基FMD-天冬氨酸質量規格：0.98D-Aspartic acid

PC-3M細胞，人前列腺癌細胞 兔主動脈平滑肌細胞,CCC-SMC-2細胞 人成纖維母細胞-HDF-aD-天冬氨酸4-叔丁酯質量規格：0.98D-Aspartic acid 4-tert-butyl ester

HFT-8810(人胎兒胸腺細胞株) 5×106cells/瓶×2非布索坦(標準品)質量規格：HPLC≥98%,標準品Febuxostat

hMo-PB single 人類外周血單核細胞團塊單一來源，預選型 > 1 mio.cells 人表皮色素細胞-中色素RNAHEM-m miRNA5 μg非那西丁質量規格：>99%,ARPhenacetin

CM-M002小鼠肺血管平滑肌細胞完全培養基100mL非那西丁(標準品)質量規格：HPLC>98%,標準品Phenacetin
IGSF8 Others Human 人 PGRL / IGSF8 人細胞裂解液 (陽性對照) 丙硫氧嘧啶（標準品）Propylthiouracil質量規格：含量測定

EB病毒轉化的人B細胞;KMY0906D-核糖-5-1酸二鈉鹽D-Ribose 5-phosphate di salt hydrate質量規格：>85%,美國進口

CNE2細胞，人鼻咽癌細胞(低分化) 小鼠骨髓瘤細胞,P3/NSI/1-Ag4-1[NS-1]細胞 蚊源細胞蘇木色精，蘇木素Hematoxylin質量規格：進分

NCI-H1650(人非小細胞肺癌細胞) 5×106cells/瓶×2核苷酸5’-一1酸腺苷鈉鹽;AMP鈉鹽Adenosine 5‘-monophosphate  salt質量規格：>98%,BR

Promocell C-24305 Melanocyte Growth Medium M2 (prf), 色素細胞生長培養基M2型套裝，無酚紅 500mlCTP.Na2；胞苷-5’-三1酸二鈉鹽CTP.Na2質量規格：>95%,BR
AE-1雜交瘤細胞抗AChE AE-1 hybridoma cells against AChE DMEM+10% Hyclone 滅**清Sp--腺苷 3′,5′-環單硫代1酸酯 三乙基銨鹽水合物質量規格：美國進口Sp-Adenosine 3',5'-cyclic monophosphorothioate triethylammonium salt hydrate

IGF2BP2 Protein Human 重組人 IGF2BP2 / IMP2 / p62 蛋白 (His & GST 標簽)2-甲基硫代二1酸腺苷質量規格：美國進口2-(Methylthio)adenosine 5'-diphosphate 3 salt hydrate

Hce-8693(人盲腸腺癌細胞(未分化)) 5×106cells/瓶×2 球狀少突細胞培養基OsM腺苷-2',3'-環1酸 三乙基銨鹽質量規格：美國進口Adenosine 2',3'-Cyclic Phosphate Triethylammonium Salt

神經小膠質細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)腺苷 3'-1酸 5'-1酰硫酸鋰鹽水合物質量規格：美國進口Adenosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate lithium salt hydrate

CSK Others Human 人 CSK / C-Src kinase 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) rac (cis/trans)多奈哌齊N-氧化物質量規格：美國進口rac (cis/trans) Donepezil N-Oxide
rCF, 大鼠心臟成纖維細胞 Rattus蛋黃粉shēng huà shì jì容量：100克

EPHA4 Others Mouse 小鼠 EPHA4 / HEK8 人細胞裂解液 (陽性對照) 羅紅霉素 Roxithromycin 80214-83-1 100G 通用試劑

表達小鼠MHCⅠ類分子Kb的人胚腎細胞;293KB羌基鱗灰石 xy7noxycpctitq1306-06-2

DDR1 Others Human 人 DDR1 Kinase / CD167 (aa 444-913) 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) γ-MDH麥芽糖酶1克BR，20u/ul

CL-0372KATO III(人胃癌細胞)5×106cells/瓶×2靛基質NA
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
腸出血性大腸桿菌（EHEC）試劑盒熒光PCR法酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。