狂犬病毒試劑盒熒光PCR法

PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

原代骨細胞特制無血清添加劑Many types of cells包裝：1ml降鈣素，大鼠質量規格：>95%,BRCalcitonin, rat

ECV-304細胞，人臍靜脈內皮細胞 銅綠假單胞桿菌(綠膿桿菌) 人成纖維細胞-總RNAHDF-a NA降鈣素基因相關肽（8-37），人質量規格：>95%,BRCalcitonin Gene Related Peptide (8-37), human

R 1610(倉鼠肺細胞) 5×106cells/瓶×2降鈣素基因相關肽Ⅱ，人質量規格：>95%,BRCalcitonin Gene RelatedPeptide II, human

ES-2(人卵巢透明細胞癌細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0263BGC-803(人胃癌細胞)5×106cells/瓶×2 貓腎細胞;F81降鈣素基因相關肽，大鼠質量規格：>95%,BRCalcitonin Gene RelatedPeptide, rat

小鼠腎足細胞;Mouse podocyte降二氫辣椒堿質量規格：HPLC≥95%,標準品Nordihydrocapsaicin
QGY-7701(人肝癌細胞) 5×106cells/瓶×2 大鼠 EphA3 人細胞裂解液 (陽性對照) 醋酸組氨瑞林 Histrelin Acetate質量規格：BR,度>98%

人結直腸腺癌細胞;COLO 205青霉素V鉀Penicillin V potassium salt質量規格：1440~1680 U/mg,BR

CD47 Others Human 人 CD47 人細胞裂解液 (陽性對照) 2'-脫氧肌苷2'-deoxyinosine質量規格：>98%,BR

mEPC, 小鼠內皮祖細胞-骨髓鹽酸尼非卡蘭Nifekalant 質量規格：>98%,BR

3T3TK細胞，小鼠成纖維細胞 TNFa轉染耐VP16絨癌細胞,JEG-3-VP16-TNFa細胞 人滑膜細胞RNAHS miRNA5 μg鹽酸尼非卡蘭(標準品)Nifekalant 質量規格：HPLC>99%,標準品
EGFL7 Protein Human 重組人 EGFL7 / VE-statin 蛋白 (His 標簽)HCTISSUEFIXATIVE100/CS組織固定劑組織學級30MLRT

WL1(大鼠肺細胞) 5×106cells/瓶×2 原代肝實質細胞特制基礎培養基Many types of cells包裝：500/250/100ml硼醋 Boric ccid (cS);Borofcx 10043-32-3

人肺動脈平滑肌細胞總RNAHPASMC NABOC-L-TryptophanN-叔丁氧羰基-L-色酸10克BR，99%

PLA2G2E Others Mouse 小鼠 PLA2G2E 人細胞裂解液 (陽性對照) LACTOSE乳糖美國國家**級 50KG

U973 人白血病細胞(新霉素)
CL-0101Hela(人細胞)5×106cells/瓶×22-壬醇250毫克保存：-20℃

WI-38細胞，人二倍體細胞系 人EBV陽性B瘤細胞,P3HR1細胞 615小鼠樹突狀細胞肉瘤瘤株;DCS4 4-(六拂異亞炳基)二本安 98% 2,2-Bis(4-cminophqnyl)hqxcfluoropropcnq 1092-78-9

Bcap-37(人癌細胞) 5×106cells/瓶×2重酸100克

CTSL1 Others Human 人 CTSL1 / Cathepsin-L1 人細胞裂解液 (陽性對照) BigCHAP(3a,5b,7a,12a)-N,N-雙[3-(D-葡萄糖?；?span>)基]-3,7,12-三羥基膽甾烷-24-胺5克SP，98%

急性T細胞白血病細胞;TALL-10450-69-1D(-)核糖(+4℃)D-Ribose
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
狂犬病毒試劑盒熒光PCR法三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

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