禽流感病毒試劑盒熒光PCR法

產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
禽流感病毒試劑盒熒光PCR法三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
TE-13(人食管癌細胞) 5×106cells/瓶×2炔孕酮/素(標準品)質量規格：>98%,標準品Ethisterone

HBdMEC Pellet 人膀胱微血管內皮細胞團塊 > 1 mio.cells 胰酶/EDTA消化液T/E炔孕酮/素質量規格：>98%Ethisterone

CL-0286M1(小鼠白血病細胞)5×106cells/瓶×2D-胱氨酸質量規格：0.98D-Cystine

HA Others H3N2 甲型流感 H3N2 (A/Victoria/210/2009) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細胞裂解液 (陽性對照) D-阿拉伯糖醇質量規格：>98%,BRD(+)-Arabitol

人滋養層絨毛細胞cDNAHVT cDNA米吐爾(>98%,BC)質量規格：>98%,BCMetol
豹貓肺成纖維樣細胞;LCL3BOC-D-絲氨酸甲酯BOC-D-Serine methyl ester質量規格：>98%,BR

CNE1, 人鼻咽癌細胞系BOC 精氨酸Boc-Arg(Pbf)-OH質量規格：0.98

人纖維肉瘤細胞;HT-1080 大鼠腸平滑肌細胞完全培養基 100mLBMS-345541BMS345541質量規格：>98%,BR

腦靜脈血管內皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)IKK-16,選擇性IKK抑制劑IKK16質量規格：>98%,BR

PDGFRB Others Cynomolgus 食蟹猴 PDGFRB / PDGFR-1 人細胞裂解液 (陽性對照) 曲格列汀琥珀酸鹽 Trelagliptin succinate；SYR-472質量規格：>98%,BR
CEACAM5 Others Human 人 CEACAM5 / CD66e 人細胞裂解液 (陽性對照) 2,2'-雙(羥甲基)二苯(>98.0%(GC))質量規格：>98.0%(GC)2,2'-Bis(hydroxymethyl)diphenyl Ether

人外根殼細胞RNAHHORSC miRNA5 μg雙(2-甲酰苯基)(>98.0%(GC))質量規格：>98.0%(GC)Bis(2-formylphenyl) Ether

CFHR2 Others Human 人 CFHR2 / FHR2 / HFL3 人細胞裂解液 (陽性對照) 1,3-雙(4-氨苯氧基)苯(>98.0%(GC)(T))質量規格：>98.0%(GC)(T)1,3-Bis(4-aminophenoxy)benzene

人臍靜脈平滑肌細胞完全培養基 100mL4-氨基-4'-氯二苯(>97.0%(GC)(T))質量規格：>97.0%(GC)(T)4-Amino-4'-chlorodiphenyl Ether

BRL大鼠Buffalo細胞，大鼠肝細胞 SH-SY5Y(神經母細胞瘤細胞) 人肺粘液上皮樣癌細胞;NCI-H2921,4,8,12-四氮雜環十五烷(>97.0%(T))質量規格：>97.0%(T)1,4,8,12-Tetraazacyclopentadecane
tTA基因修飾的小鼠畸胎瘤細胞(B類);F9-CAG-tTA-1A3酚酞單嶙酸二環己鹽，英文名或英文縮寫：pxenolphthalein monophosphate bis(cyclohexylammonium) salt，級別：試劑級，95%，規格：500毫克

TNFSF8 Others Rat 大鼠 CD153 / CD30L / TNFSF8 人細胞裂解液 (陽性對照) 鄰基隊本二酚 2-Mqthylxy7noinoneonq 92-71-6

膀胱平滑肌細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)嗜熱菌蛋白酶，英文名或英文縮寫：Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko，級別：生物技術級，30u/mg，規格：25克

EC-304細胞，人血管內皮細胞 小鼠腎癌細胞,Kert-3細胞 人脈絡叢上皮細胞總RNAHCPEpiC NA對羥基，英文名或英文縮寫：PHBA，級別：BR，99%，分子量600，液體，規格：5克

QG-56(人肺扁平上皮癌細胞) 5×106cells/瓶×281-30-11,4,5,8-四二酐1,4,5,8-tetracarboxylic dianhydride
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。