PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強
儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
|
產品名稱
|
EB病毒試劑盒熒光PCR法
|
|
規格
|
50T
|
|
貨號
|
XG-R63734
|
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
人虹膜色素上皮細胞RNAHIPEpiC miRNA5 μg表兒茶素沒食子酸酯(標準品)(?)-Epicatechin
gallate/ECG 質量規格：HPLC≥98%，標準品
LILRA5 Others Rat 大鼠 LILRA5 人細胞裂解液 (陽性對照) 表告依春（標準品）Epigoitrin質量規格：HPLC≥98%，標準品
人心室肌細胞完全培養基 100mL表沒食子兒茶素（標準品）(?)-Epigallocatechin/EGC 質量規格：HPLC≥98%，標準品
PC-12細胞，大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(低分化) 22RV1(前列腺癌細胞) 人肝癌細胞;SMMC-7721表小檗堿（標準品）Epiberberine質量規格：HPLC≥98%，標準品
PF4 Protein Human 重組人 CXCL4 / PF4 蛋白濱蒿內酯（標準品）Scoparone質量規格：HPLC≥98%，標準品
倉鼠卵巢細胞;Lec1N-乙酰-DL-丙氨酸N-Acetyl-DL-Alanine質量規格：0.98
BEL-7405細胞，肝癌細胞 膀胱癌細胞,BI U-87細胞 615小鼠樹突狀細胞肉瘤瘤株;DCSOSI-420，游離堿（去甲埃羅替尼）OSI-420, Free
Base (Desmethyl Erlotinib)質量規格：美國進口
小鼠肺腺癌低轉移細胞(綠色熒光蛋白標記);LA1-GFP非那雄胺 2-(2-甲基丙醇）酰胺Finasteride
2-(2-Methylpropanol)amide質量規格：美國進口
CD274 Others Mouse 小鼠 B7-H1 / CD274 / PD-L1 人細胞裂解液 (陽性對照) 6α-羥基非那雄胺6α-Hydroxy
Finasteride質量規格：美國進口
人腸微血管內皮細胞裂解物HIMECL非那雄胺羧酸Finasteride Carboxylic Acid質量規格：美國進口
U251(人膠質瘤細胞) 5×106cells/瓶×2對胺100克
HUF-c 人類成纖維細胞(HUF) 500,000cells 腎上皮細胞Many types of
cells包裝：5 × 105方(1ml)2,3-二錄本加醋 2,3-Dichlorobqnzoic ccid 20-42-3
卵巢成纖維細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)癸酸500毫克
FCGR2A Others Cynomolgus 食蟹猴 CD32a / FCGR2A 人細胞裂解液 (陽性對照) 遠藤氏瓊脂培養基250克RT
MIN6 小鼠胰島素瘤細胞4595-60-22-溴嘧啶2-Bromopyrimidine
EB病毒轉化的人B細胞;HH-01 人腦靜脈血管內皮細胞完全培養基 100mLDSCN,N'-琥珀基碳酸酯10克高，98.5%
大鼠氣管上皮細胞;RTE花生醋;正二十醋 crcchidic
ccid;crcchic ccid;n-qicoscnoic ccid;qicosoic ccid 206-30-9
CD36 Others Rat 大鼠 CD36 / SCARB3 人細胞裂解液 (陽性對照) 5-AMP瓊脂糖凝膠4Bshēng huà shì jì容量：30U
腸粘膜上皮細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)5′-UTP,3Na尿苷-5′-三嶙酸三鈉鹽1000UBR，99%
HASMC細胞，人大動脈平滑肌細胞 小鼠自發高癌細胞,TA2細胞 人虹膜色素上皮細胞cDNAHIPEpiC
cDNAGDX 102(聚二本多孔小球)NA
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM）
2μl
引物2（10PM）
2μl
Taq酶（2U/μl）
1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至
50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
EB病毒試劑盒熒光PCR法三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。