乙型肝炎病毒ccc DNA(HBV-cccDNA)試劑盒熒光PCR法

PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
產品特點: 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實驗結果重復性強
擴增性能優：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

人星形膠質細胞 (HA) (1×106 ) 小鼠皮層神經膠質細胞(EGFP標記) Mouse釩標準溶液(100mg/L,基體:1%HCI)質量規格：100mg/L,基體:1%HCIVanadium standard

CM-H073人膀胱成纖維細胞完全培養基100mL鐿標準溶液(1000μg/ml)質量規格：1000μg/mlYtterbium standard

TNFRSF10D Others Cynomolgus 食蟹猴 AIL R4 / CD264 / TNFRSF10D 人細胞裂解液 (陽性對照) 地西他濱/ 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷質量規格：>99.5%,BR,可用于細胞培養Decitabine

人成纖維母細胞-新生HDF-n地西他濱/ 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（標準品）質量規格：HPLC>98%,標準品Decitabine

RWPE-1細胞，人正常前列腺上皮細胞 小鼠B細胞雜交瘤細胞,SH3細胞 成纖維細胞培養基-2(用于心肌成纖維細胞)FM-25-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷質量規格：>97%,進分sigma貨號A3656 5-Aza-2′-deoxycytidine
人肺癌細胞;A549 [A-549] 人腦成纖維細胞完全培養基 100mL5-O-去甲基奧美拉唑硫化物5-O-Desmethyl Omeprazole Sulfide質量規格：美國進口

人肝竇內皮細胞cDNAHHSEC cDNA奧美拉唑 Omeprazole質量規格：>99%,USP33,BR,可用于細胞培養

小鼠胚胎成纖維細胞(MEF-mt)(5×105)奧美拉唑 （標準品）Omeprazole質量規格：HPLC>98%,標準品

大鼠肝細胞;IAR20氯唑沙宗Chlorzoxazone質量規格：>98.5%,BR

小鼠誘導性多潛能干細胞;PUMC-mips-A2 小鼠肝外膽管上皮細胞完全培養基 100mL氯唑沙宗（標準品）Chlorzoxazone質量規格：HPLC>98%,標準品
人內膜腺癌細胞;HEC-1-B磺胺二甲氧嗪; 磺胺二甲氧基嘧啶質量規格：>99%,ARSulfadimethoxine

人成纖維母細胞-(HDF-a)( 5×105 )磺胺二甲氧基嘧啶(標準品)質量規格：HPLC>98%,標準品Sulfadimethoxine

人星形膠質細胞奧斯他偉酸;奧司他韋羧酸質量規格：>97,BROseltamivir acid

人結直腸腺癌細胞;LoVo 大鼠輸尿管上皮細胞完全培養基 100mLalpha-熊果苷(標準品)質量規格：HPLC≥98%,標準品alpha-Arbutin

PC-12(高分化) 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(高分化)L-甲狀腺素鈉鹽五水化合物質量規格：>98%,BRL-Thyroxine  Salt Pentahydrate
SLAMF6 Others Human 人 SLAMF6 / Ly108 人細胞裂解液 (陽性對照) D-乳酸脫氫酶1克保存：-20℃，避光

CL-0005293T(人胚腎細胞)5×106cells/瓶×22,6-二本安;2-安基間二本;1-安基-2,6-二本;2-安基-1,3-二基本;連間二本安 2,6-DiMqthylcnilinq;2-cMino-1,3-diMqthylbqnzqnq;vic-M-Xylidinq;2,6-Xylidinq;2-cMino-M-xylqnq;1-cMino-2,6-diMqthylbqnzqnq1987/6/7

乙型肝炎病毒ccc DNA(HBV-cccDNA)試劑盒熒光-PCR法KB/V細胞，人口腔上皮癌長春新堿耐藥株 人血管內皮細胞,EC-304細胞 大鼠骨髓瘤細胞;Y3-Ag1.2.3磺胺二5克2～8℃

BxPC-3(人原位胰腺腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2嶙酸三鈉100克

CN3 Others Human 人 CN3 / Coactin-3 人細胞裂解液 (陽性對照) 1921-70-6姥鮫烷PRISTANE