登革熱病毒試劑盒PCR熔解曲線(xiàn)法

PCR實(shí)驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  

產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數的基因
特異性高：有效避免非特異性擴增的出現
穩定性高：復孔間差異小，實(shí)驗結果重復性強
擴增性能優(yōu)：擴增效率高，熒光信號強

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內**的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

小鼠肝動(dòng)脈平滑肌細胞完全培養基 100mL13X分子篩(80-100目,氣相、液相色譜柱)質(zhì)量規格：80-100目,氣相、液相色譜柱Molecular sieves Type 13X

K7M2 wt [K7M2-WT]小鼠骨肉瘤成骨細胞 K7M2 wt [K7M2-WT] murine osteosarcoma cells DMEM培養基+10%FBS13X分子篩(40-60目,氣相、液相色譜柱)質(zhì)量規格：40-60目,氣相、液相色譜柱Molecular sieves Type 13X

IL6 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 / 恒河猴 IL6 / Ierleukin-6 蛋白13X分子篩(干燥劑用)質(zhì)量規格：干燥劑用Molecular sieves Type 13X

RL1(大鼠肺成纖維樣細胞) 5×106cells/瓶×2 JAR(胚絨毛癌細胞)13X分子篩(3-5mm,球形)質(zhì)量規格：3-5mm,球形Molecular sieves Type 13X

CL-0140LLC(小鼠肺癌細胞)5×106cells/瓶×213X分子篩(2-3mm,球形)質(zhì)量規格：2-3mm,球形Molecular sieves Type 13X
兔主動(dòng)脈平滑肌細胞;CCC-SMC-1吡嗪(>98.0%(GC))Pyrazine質(zhì)量規格：>98.0%(GC)

小鼠色素瘤細胞;B16-F1 小鼠關(guān)節軟骨細胞完全培養基 100mL2,3-吡嗪二羧酸(>98.0%(HPLC)(T))2,3-Pyrazinedicarboxylic Acid質(zhì)量規格：>98.0%(HPLC)(T)

HSC-T6, 大鼠肝星狀細胞系 Rattus茴香偶酰(>98.0%(GC))p-Anisil質(zhì)量規格：>98.0%(GC)

ACVR2A Others Human 人 ACVR2 / ACII / ACVR2A 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 苯偶酰(>99.0%(GC))Benzil質(zhì)量規格：>99.0%(GC)

人海馬趾神經(jīng)細胞HN-h苯偶酰 (區域精制法精制,熔段數:22)Benzil Zone Refined (number of passes:22)質(zhì)量規格：
HEL299細胞，紅白細胞白血病細胞 巨核細胞,Dami細胞 人纖維肉瘤細胞;HT-1080BOC-ON2-(叔-丁氧基碳酰胺)-2-本以100毫克BR，99%

KM小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤瘤株;G422?；悄懰徕c  taurocholate hydrate,≥97.0% 145-42-6 1G 通用試劑

CD226 Others Mouse 小鼠 DNAM-1 / CD226 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) 馬脲酰組安酰亮安醋(-20℃) HIPPURYL-HIS-LqU 31373-62-6

人上皮細胞HMEpiCβ-葡萄糖苷酸酶100克

FCGR2B Others Rat 大鼠 CD32b / FCGR2B 人細胞裂解液 (陽(yáng)性對照) PH緩沖液 PH12.0(20℃)NA
104-54-1肉桂醇規格  Cinnamyl alcohol    英文名稱(chēng)RatCD40LELISAKit大鼠CD40L規格：96T/48T

104472-68-6香蒲新苷廠(chǎng)家  Typhaneoside  英文名稱(chēng)RatCD30ELISAKit大鼠CD30規格：96T/48T

104-46-1反式茴香腦說(shuō)明書(shū)  cis-Anethol   英文名稱(chēng)RatCD26ELISAKit大鼠CD26規格：96T/48T

104-46-1反式茴香腦品牌  Anethole   英文名稱(chēng)RatCD23ELISAKit大鼠CD23規格：96T/48T

104112-82-5鹽酸黃柏堿廠(chǎng)家  Phellodendrine chloride  英文名稱(chēng)RatCD163ELISAKit大鼠CD163規格：96T/48T
實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
登革熱病毒試劑盒PCR熔解曲線(xiàn)法三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾高壓。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。