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產品名稱:二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)比色法檢測試劑盒100管/96樣
規格 : 100管/96樣
測試方法:微量法
商品介紹:
測定意義:
核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個關鍵酶,既控制著CO2的固定,同時又制約著碳素向Calvin循環和光呼吸循環分流,其活性的大小直接影響著光合速率。
測定原理:
在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)與1分子的CO2結合,產生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產生甘油醛-3-磷酸,并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的變化可計算還原型輔酶I氧化速率,還原型輔酶I氧化速率可反應Rubisco的活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
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特點:
1、優化設計的實驗方案,1小時即可完成
2、靈敏度高,操作便捷
3、試劑盒提供檢測所需的全套試劑
常見樣本處理方法:
1、血清(漿)樣品:直接檢測。
2、細胞或組織樣品的制備: 培養細胞:先收集細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細胞數量
(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議 500萬細胞加入 1mL提取液) ,超聲波破碎細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲 3s,間隔10s,重復30 次)8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g) :提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g組織,
加入 1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
實驗通用規則:
1、洗液不夠時,可用蒸餾水自行配制PH7.4,0.02M的磷酸緩沖液,加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。
2、液體全部加完后,可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒,混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。
3、底物有一定的毒性,終止液對皮膚有腐蝕性,應盡量避免接觸。
4、檢測前,要打開酶標儀,使之穩定10分鐘以上。
5、吸取液體時,要用量程和需要量接近的槍去吸,減少誤差。
6、將液體加到酶標孔中時,避免槍頭和孔內液體接觸,可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,液滴會自然流下去。
7、溫浴時,要用不干膠或膠帶紙封好酶標板,防止水分的蒸發。
8、洗板時,每次洗液加入后,應靜置1分鐘,使清洗更加徹底。沒有洗板機時,倒去液體后,要將酶標板在報紙或毛紙上用力拍干。
9、用槍吸取液體時速度不能太快,以免產生氣泡而使吸取量不準確。
10、底物是光敏感的,要在臨用前現配。
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測定步驟:
1.加樣
1. 除包被外都需45度加樣
2.加樣體積要準確
3.管底加樣,不能加在管壁上
4.加樣時不能產生氣泡
2.溫浴
1.加標本后和加結合物后,應立即放入按規定的反應溫度的水浴箱。
2.各ELISA板不應疊在一起。
3.為避免蒸發,板上應加蓋,或將板平放在底部墊有濕紗布的金屬濕盒中。
4.加入底物后,反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。 如室溫高于20℃,ELISA板可避光放在實驗臺上,以便 不時觀察,待對照管顯色適當時,即可終止酶反應。
3.洗滌
1.洗滌在ELISA過程中不是反應步驟,但卻是決定實驗成敗的關鍵。
2.目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或 抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。